文献类型： 中文期刊

作者： 陈曦 ¹ ; 杨金先 ¹ ; 李英英 ¹ ; 陈强 ¹ ; 黄小红 ² ; 宋铁英 ¹ ; 葛均青 ¹ ;

作者机构： 1.福建省农业科学院生物技术研究所

2.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)

关键词： 鳗鲡疱疹病毒(AngHV);ORF87基因;原核表达;多克隆抗体;免疫原性

期刊名称： 南方农业学报

ISSN： 2095-1191

年卷期： 2022 年 53 卷 002 期

页码： 538-545

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF87基因,分析其序列特征并制备多克隆抗体,为揭示ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用机制提供技术支持.[方法]根据GenBank已公布AngHV参考株(NC_013668)的ORF87基因序列设计引物,从AngHV-FJ株基因组中扩增出ORF87基因,构建重组质粒pMD19-ORF87经酶切鉴定和测序验证后,采用Softberry、ProtParam、CDD、TMHMM、SignalP 5.0、PSORT及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;将ORF87基因克隆至pET-32a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定;以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备ORF87多克隆抗体.[结果]克隆获得的AngHV-FJ株ORF87基因为2127 bp,与GenBank已发布的参考序列高度同源(相似性为99.72%),仅存在4个碱基突变;其编码蛋白分子量为80.1 kD,理论等电点(pI)为7.62,不稳定系数为42.38,总平均亲水性为-0.271.ORF87蛋白具有蛋白激酶C超家族(PKC-like Superfamily)的保守结构域,但不具信号肽和跨膜结构域;其亚细胞定位可能位于细胞核和细胞质膜,存在19个潜在B细胞抗原表位,即具有良好的免疫原性.AngHV-FJ株ORF87基因可在大肠杆菌中高效表达,表达获得的融合蛋白约100.0 kD,主要以包涵体形式存在;以融合蛋白免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体效价达1:16000,能特异性识别AngHV的ORF87蛋白.[结论]AngHV-FJ株源ORF87基因经原核表达载体诱导表达获得的融合蛋白ORF87具有Serine/threonine蛋白激酶活性,以其免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体具有高效价,能特异性识别AngHV感染,可作为亚细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用.